食品安全质量检测学报在线阅读
环介导等温扩增技术在病原微生物快速检测中的研究进展
杨靖，胡姣姣，柏先泽 ，王远亮，谢康庄
(1. 湖南农业大学食品科学技术学院，长沙410128；
(2. .三旺实业有限公司，溯源 411300
----文章选自食品安全质量检测学报杂志
摘要：病原徵生物是危害人类健康的最主要影响因素之一，快速、准确地鉴定病原散生物对保障人类健康具有重要意义。环介导等温扩增技术(loop-meditated isothermal amplification, LAMP)是一-种新型的等温核酸护增技术，具有特异性高、灵敏度高、快速、经济、简便的优点。可以与其他新技术结合，弥补其引物设计困难和易被污染的不足，使其能够在更多领域应用，尤其是在资源贫乏地区的基因检测以及食品的快速检测和基层检测。本文就环介导等温扩增的基本原理、特点及在病原微生物检测中的应用对近些年的研究进展进行综述，并对环介导等温扩增未来发展方向进行展望，为环介导等温扩增技术的进一步发展提供参考。
关键词：环介导等温扩增；病原微生物；基本原理；快速检测；基层检测
Research progress of loop-mediated isothermal amplification technology
in rapid detection of pathogenic microorganisms
YANG Jing', HU Jiao-Jiao', BAI Xian-Ze', WANG Yuan-Liang", XIE Kang-Zhuang”
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
2. Sanwang Industrial Co., Litd, Xiangtan 411300, China)
ABSTRACT: Pathogenic microorganisms is one of the most imporian: factors influencing human health. Rapid and contamination, and enable it to be applied in more fields, especially genetic testing in resource-poor areas and rapid combined with other new technologies to make up for the difficully in the design of primers and the lack of technologies, it has the advantages of high specificity, high sensitivity, rapid, economic and convenient. It can be Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a new kind of isohermal nucleic acid amplification accurate identification of pathogenic microorganisms has important meaning in protecting human health.food detection at the grassroots level. This paper reviewed the research progress in recent years on the basic principles, characteristics and application of LAMP in the detection of pathogenic microorganisms, and looked forward to the fiture development direction of LAMP, providing references for the further development of LAMP technology.
KEY WORDS: loop-mediated isothermal amplification; pathogenic microorganisms; basic principle; rapid detection; basic-level detection
1 引言
我们生活在微生物的时代，微生物影响着我们生活的方方面面。我们一方面享受着微生物带来的便利，如品尝着醇香的白酒，享用着美味的奶酪等。另一方面，我们也饱受微生物的困扰，由各种微生物带来的食物中毒，病菌感染时刻威胁着我们的身体健康，这些能够引起人类或动物疾病的微生物又被称为病原微生物，它包括病毒、细菌、真菌、原生动物等'"。它们可以通过空气、食物等途径传播且传播速度极快”。因此，对病原微生物进行快速的检测能够让我们提前发现并解决其带来的危害。在过去的几十年里，病原微生物检测和鉴定方面取得了巨大进步,现有的检测方法主要有传统培养法、免疫学检测方法、分子生物学检测方法，以及以此类方法为基础、多学科交叉发展起来的新型检测技术，如传感器技术、生物芯片技术等。传统培养法检测结果相对精确，但耗时太长，若同时检测大量样品，工作量大且效率不高。免疫学检测方法检测结果灵敏度高，特异性强，检测时间相对较短，但依赖于昂贵的检出设备，难以普及至基层检测。分子生物学检测方法中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(reverse-transcription- polymerasechain reaction, RT-PCR)、实时荧光定量-聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, real-timc PCR)等是现在应用较广的检测技术，但这些方法较为繁琐或是依赖于较昂贵的设备，难以适用于现场检测。
环介导等温扩增技术(loop-meditated isothermalamplification, LAMP)是 Notomi 等“开发的一种等温核酸扩增技术。它依靠 2 对引物，在恒定的温度(61~65 ℃),在具有高链置换活性的 DNA 聚合酶作用下，以脱氧核糖核苷三磷酸为原料进行 DNA 合成反应。反应能在 1 h内完成，具有快速、简易、高特异性，不依赖于昂贵检测设备的优点甲，使其能够用于资源贫乏地区的基因检测、食品和环境样品的快速检测及现场检测。本文就 LAMP 的原理、特点及近些年的发展及应用进行综述，并对其未来发展作出展望，为环介导等温扩增技术的进一步发展提供
2 环介导等温扩增技术原理、特点及应用
2.1 基本原理
LAMP 的引物数量一般是 4~6 条。在设计时，先确定目标基因上的 6 个特异性区域 F3、F2、F1、B1、B2、B3(图1), F1c 和 B1c 的熔解温度(Tm)一般在 64~66 C, F2、B2、F3、B3 的 Tm 一般为 59~61 ℃，然后依据这 6 个特异性区域设计 4 条引物:正向内引物(forward inner primer, FIP),由Flc和F2组成;反向内引物(backward inner primer, BiP),由 B1c 和 B2 组成，中间均以 TTTT 作为间隔，内引物长度一般在 30~44 个碱基；外引物 F3、B3 分别由目的基因上的 F3、B3 区域组成,长度一般为 15~20 个碱基。Nagamine 等'提出增加一对促环引物 LF 和 LB 参与反应,可以提高扩增效率，将反应时间缩短三分之一甚至二分之一。
LAMP 主要有 3 个阶段，第一阶段，模板合成阶段，在 LAMP 反应体系中,内引物的浓度几倍于外引物的浓度,因此，内引物会先与模板链结合合成互补链，形成DNA 双链。随后外引物再与该模板链结合，形成 DNA 双链，在Bst DNA 聚合酶的作用下，释放出由内引物合成的互补链，该互补链经过一系列反应最终形成具有哑铃结构的 DNA单链，该单链是后续循环扩增的模板。第二阶段，循环扩增阶段，以哑铃结构 DNA 单链自身为模板依据第一阶段
的反应原理不断形成一端开口的过渡性茎环结构 DNA。该DNA 链作为第三阶段的反应模板。第三阶段，延长和再循环阶段，由内外引物引导过渡性茎环结构 DNA 不断发生链置换延伸反应，最后形成具有多个茎环结构和花椰菜结构的长度不一的 DNA 混合物鬥。
2.2 环介导等温扩增技术特点及其发展
2.2.1 LAMP 特点
LAMP将模板加入反应体系中进行扩增，扩增结束后目视观察即可判断反应是否发生，步骤简单；LAMP 的等温扩增特性使其只需一个恒温水浴锅就能满足反应要求，仪器成本低；同时它也不需要进行 DNA 的变性及复性步骤。节省了反应时间。其次，4 条引物的特异性识别，提高了扩增效率。LAMP 结果观察和产物检测主要有3种方法,一为浊度法，LAMP 反应过程中会生成焦磷酸镁沉淀，通过观察是否产生沉淀判断反应是否发生，同时由于沉淀的产生会改变反应液的浊度，因此可测定实时浊度实现LAMP 的定量检测*”。二为荧光检测法。在 LAMP 反应体系中加入二价锰离子和钙黄素，若反应成功扩增，在紫光灯或是日光的照射下能看到溶液颜色为明亮的绿色吗,可以实现 LAMP 的不开盖可视化检测,避免气溶胶污染。后续研究发现, SYBR Green 染料具有比钙黄素更高的灵敏度，向反应体系中加入相应比例的荧光染料，测定反应的实时荧光值，可实现 LAMP 的定量检测。三为凝胶电泳法。将反应产物进行琼脂糖电泳，根据是否看到阶梯状条带判断反应是否发生。
2.2.2 逆转录环介导等温扩增
逆转录环介导等温扩增(reverse transeriptionloop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)基本原理与操作与常规 LAMP基本相同，不同的是扩增模板使用的是 RNA，需在反应开始前向体系内加入逆转录酶。RT-LAMP 具有与 LAMP 相似的灵敏度和特异性。
2.2.3 多重环介导等温扩增
多重环介导等温扩增(multiplex loop-mediatedisothermal amplification, multiplex LAMP)是指在单管反应体系试剂内加入几组引物进行扩增反应，扩增产物通过酶切反应、实时荧光或是实时浊度测定实现对多种病原微生物的特异性检验”。其优点是在保证特异性和灵敏度的前提下提高检测效率，节约试剂成本和时间成本，但也存在一些不足，首先，所需引物数量多，为避免形成引物二聚体及二级结构，发生非特异性扩增，对引物的要求变高,增加了引物设计的难度。其次，在对扩增产物进行酶切分析时，存在酶切时间长，酶切产物不单一，结果难以准确判断以及开盖可能造成的气溶胶污染等问题。
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